园艺专业教学设计园艺植物的繁殖—组织培养繁殖教案

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第五章园艺植物的繁殖教案第三节组织培养繁殖
组织培养繁殖是指在无菌而又有适合植物生长发育所需营养物质的环境条件下，通过培养植物细胞、组织、器官，使之分生出新植株的一种现代繁殖技术。
一、组织培养繁殖的优势
①繁殖速度快，繁殖系数高，全年都可进行繁殖。
②占用空间小。
③可以培养脱毒种苗。
相关概念
外植体：组织培养的材料。
初代培养：植物组织培养中,从最初接种的外植体上产生的组织、器官、植株等,称为初代培养。
继代培养：将初代培养获得的培养体移植于新鲜的培养基中，这种反复多次的培养为……。
二、组织培养的类型
植物培养：幼苗及较大的完整植株的培养。
胚胎培养：成熟及未成熟胚胎的离体培养，即胚、胚乳、胚珠、珠心、子房培养及试管受精等。
器官培养：构成植物体各种器官的离体培养，包括根、茎、叶、花、果实等。
愈伤组织培养：植物离体部分通过培养增殖而形成的愈伤组织的培养。
组织培养：构成植物体的各种组织的离体培养，如分生组织，输导组织，薄壁组织等离体组织的培养。
细胞培养：包括细胞悬浮培养和单个细胞的培养。
原生质体培养：去掉细胞壁后所获得的细胞原生质体的培养。
三、组织培养繁殖的一般技术
(一)培养基的配制
培养基主要成分由矿质营养元素、有机物质、生长调节物质和碳源等组成。
常用培养基主要有：MS；MT；White; Nitsch；B5；N6 ； ER ； HE等培养基。
选定培养基,配制母液。培养基中有机成分以及激素的母液应保存在4℃冰箱中，可使用1-2个月。使用时稀释，并加入蔗糖，定容，调pH，一般的pH为5.5-6.5。
提示：一定要调整pH，如果不调整pH的话，培养基会如何？
固体培养基：应加入0.6%-1.0%的琼脂，然后融化，分装在三角瓶或者试管中。如采用滤纸桥培养，则不需要加入琼脂，pH值调整好后直接分装，最后进行消毒。
激素的使用
培养基需加入植物激素才能使外植体产生愈伤组织或启动分裂。
生长素：萘乙酸（NAA），2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），吲哚乙酸（IAA），吲哚丁酸（IBA）等。
细胞分裂素：6-苄基嘌呤（6-BA）、激动素（KT），玉米素（ZT）等。
一些树种也使用赤霉素（GA）来促进试管苗的生长。有人在烟草的组培中发现，培养基中生长素/细胞分裂素的比例对于培养物的形态分化有着极其重要的作用。两者比例高时有利于生根，低时有利于芽的化分。处于平衡时有利于愈伤组织的生长。
(二)消毒
配制好的培养基、接种用具等用高压灭菌消毒；接种室用1:50的新洁尔灭湿性消毒，每次接种前用紫外灯照射消毒20-30min，并定期用甲醛熏蒸消毒；性质不稳定、不耐高温高压的化学药品，可以选用过滤法除菌。
(三)外植体的准备与消毒
外植体可以先通过培养无菌苗获得，也可直接取于普通植株。先用70%酒精消毒20-30s，再用饱和漂白粉溶液消毒10-20min或用0.1-1%氯化汞消毒2-10min,接着用无菌水冲洗4-5次，放在消毒的培养皿中准备接种。
（四)接种
接种的全过程应在无菌条件下进行。一般在超净工作台前将无菌的外植体接入培养基中。接种人员要彻底洗手，并用70%酒精擦拭，同时戴口罩、帽子，穿工作服等，以防接种污染。
(五)植物材料培养
培养室温度一般控制在25+2℃恒温条件下；光照强度为2000-3000lx，光照时间为10-12h；在干燥季节还要考虑提高空气湿度。
(六)移栽
组培苗移栽是组培育苗成败的关键之一。当试管苗具有3-5条根后即可移栽。先炼苗，2-4周后移到土壤中培养成苗。
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快速繁殖
材料：茎尖和带节茎段。一个兰花的茎尖一年内可育成400万个原球茎，一个草莓茎尖一年内可育出成苗3000万株。非洲紫罗兰叶片扦插年繁殖3.4倍，而用组织培养方法，年繁殖可达10万倍以上。兰花、马铃薯、柑桔、香蕉、菠萝、香石竹、马蹄莲、玉簪等多种园艺植物均已在生产上采用组织培养快速繁殖。
四、无病毒苗的培育
园艺植物病毒及其危害给园艺生产带来巨大损失；有些病毒慢性为害，导致生长衰弱，产量降低，品质下降，不耐贮运等。
（一）病毒的检测方法
1．外部形态观察：黄叶、卷叶、皱叶、植株矮小等。
2．血清学鉴定法：酶联免疫法
3．电镜检测法：利用高倍透射电子显微镜可以观察到病毒颗粒的形状、大小和结构等。常采用的方法为吐水法和浸蘸法。
4．指示植物法：有些病毒种类用血清学鉴定和电镜检查仍难以确定，必须通过指示植物人工接种鉴定。
举例：黄瓜花叶病毒和烟草环斑病毒在电镜下观察不能加以区别，但当把这两种病毒分别接种到黄瓜子叶时，烟草环斑病毒会导致褪绿枯死斑，黄瓜花叶病毒则产生系统花叶症状，无褪绿枯死病斑发生。
5．RT-PCR法(反转录聚合酶链式反应法)：具有较高的灵敏度和特异性，检测水平可达飞克水平，远远高于酶联免疫法的纳克水平。
植物体内病毒浓度很低或需检测多种病毒时，优势突出。若提取出的RNA质量不高或提取过程过长，常造成假阳性，影响检测结果。
（二）脱毒方法
1.热处理法
主要是利用某些病毒受热后的不稳定性，使植物细胞中病毒钝化，而植物本身的生长速度加快，得到不含有病毒的植物分生组织，再培育为无毒植株。
热处理的方法有两种：
(1)温汤浸渍处理法：将接穗或种质材料在50℃左右的温汤中浸渍3-15分钟至数小时。
(2)热风处理法：让盆栽植株在35-40℃高温下生长发育，热处理温度逐渐升高，然后达到所需要的温度，同时必须保持一定的温度和光照，以后可切取处理后的新长出的枝条安排作接穗和砧木，或将热处理与组织培养法结合效果会更好。
2.茎尖培养脱毒
植株老叶片、成熟组织和器官中病毒含量较高，而幼嫩及未成熟组织和器官病毒含量较低，生长点(0.1-1.0mm)则几乎不含或含病毒很少。
茎尖大小与脱毒关系很大，一般以0.1-0.2mm，带1-2个叶原基的茎尖作为培养材料为宜；超过0.3mm，脱毒效果差。
3.茎尖微体嫁接脱毒
对茎尖培养难生根的木本果树，可进行试管茎尖微体嫁接。
以试管中的幼小植株做砧木，将茎尖分生组织嫁接其上的一种脱毒方法。比茎尖培养的成苗率高，同时生长速度也较快。
4.超低温处理脱毒
原理：易感病毒的大细胞内因含水量大，在超低温处理中易受冻害而死亡，不含病毒的小的茎尖存活下来，分化成芽，成长为脱毒苗。
超低温处理+茎尖培养：在0.5-2.0mm之间的茎尖,不影响脱毒率。