DNA提取实验探究与小结

DNA提取实验探究与小结
——拟南芥DNA小提（CTAB法）
作者：何超、郑圣、（501）章真

[内容提要]
选择开展了拟南芥的DNA提取实验。按三人三组分别提取拟南芥的DNA，经综合分析实验结果，提取出的DNA量不足,效果不明显。为此,重新分析了实验设计并探究了实验中各个步骤对实验的影响，包括材料的放置、研磨时间、DNA提取液的替换、水浴的温度、酚-氯仿的作用效果、酒精浓度对DNA沉淀的影响,总结出研磨为实验关键，并提出今后改进意见。

[关键词]
拟南芥 DNA CTAB法

[正文]
鉴于当下日益发展的基因工程及其潜在的发展前景和实用价值，在这次社会实践活动中，我们有幸联系到了浙江省林业科学研究院开展社会实践。该院的生物实验室是目前省内植物生物工程最先进的重点实验室之一，具有许多诸如食品安全检测、环境检测、植物材料分析等实验的专业设备。根据需要，我们选择了分子生物学中的基础实验拟南芥DNA提取作为实践项目。
1实验准备
1.1知识准备
20世纪50年代中期，随着沃森和克里克揭示出DNA分子的空间结构，生物学才真正开始了其揭开分子水平生命秘密的研究历程。分子生物学从分子水平研究作为生命活动主要物质基础的生物大分子结构与功能，从而阐明了生命现象本质的科学。核酸的结构和功能，包括遗传信息的传递方面又是其中的重点研究领域。如果将一种生物的 DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。这其中DNA提取作为基础中的基础具有重要意义。
本次实验的提取对象是拟南芥（Arabidopsis thaliana）。属十字花科，2年生草本，高7～40厘米，优点是植株小、每代时间短（从发芽到开花不超过6周）、结子多、生命力强（用普通培养基就可作人工培养）。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的。每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对，即只有小麦染色体组长的1/80，这就使克隆它的有关基因相对说来比较容易。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。由于有上述这些优点，所以拟南芥是进行遗传学研究的好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”。
1.2实验材料、仪器准备：
1.2.1 离心管多只，研磨棒，各种规格移液枪，枪头。
1.2.2 传统CTAB法试剂（CTAB溶液、酚—氯仿，无水乙醇，75%乙醇）。
1.2.3 探究实验试剂（NaCl溶液、75%乙醇）。
1.2.4 天平、离心机，并于实验前开启65℃水浴。
2实验过程
2.1 取约0.1g的拟南芥小苗或嫩叶，放入1.5ml离心管里（离心管口作好标记），先加入DNA提取液约100µl（加入少量提取液便于研磨），用研磨棒彻底磨碎叶片，再加入提取液约300µl，快速充分混匀；
2.2 65℃水浴静置15min以上；
2.3 加入酚－氯仿400µl，轻轻颠倒几次混匀，10000转离心8min，小心取出，抽提后，液面分层，下层为酚－氯仿，中间为一些杂质，上清为无色透明DNA溶液。取300µl上清液转移至新的1.5ml离心管；
2.4 加入约600µl的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，8000转离心5min，倒掉并吸去上清；
2.5 800µl的75％的乙醇洗DNA沉淀2次。每次8000转离心3min，倒掉并吸去乙醇；
2.6 用200µl的枪头从反方向吸去残留乙醇，离心管晾10min。
上述步骤完成后在离心管口标记实验日期时间后便可冷藏保存。
3结果
备制样品可用电泳鉴定所提拟南芥DNA的完整性，也可利用核酸分析仪确定拟南芥DNA的浓度和纯度。至此，拟南芥DNA的小提（CTAB法）基本完成。从三组实验结果看，离心管中无肉眼可见固体，提取效果不明显，由此推断拟南芥的DNA提取量不足。
4探讨
4.1拟南芥DNA提取量不足原因的探讨
经查阅有关文献和与指导老师讨论，对实验过程中出现拟南芥DNA提取量不足的原因作以下探讨：
4.1.1 从实验材料看：按要求，实验中使用的植物拟南芥以在培养皿中培养10d左右的全苗为宜，截取材料以叶及嫩茎较好，便于研磨。
本次实验过程中，可能采用了培养时间较长的植株，或是截取材料多为老茎。然而即使植株较老，或截取老茎，细胞中仍含DNA，取量均为0.1g，应不至DNA提取量不足，及时有一定影响也不是最主要原因。
4.1.2 从研磨过程看：研磨的目的是为打碎叶片，使DNA与蛋白质等其他细胞成分完全分离，并将DNA溶解于提取液。研磨前先加少量提取液是为了便于研磨。
本次实验中提取液加入时间和量均是严格按照实验要求，且仪器精确，误差极小。况且即便提取液量稍稍过量或不足，也不至影响实验。拟南芥DNA提取量不足极有可能是研磨时间不足、研磨不充分，导致未将细胞彻底打碎，拟南芥DNA未充分溶解于提取液。
4.1.3 水浴温度：水浴65℃目的是让DNA充分溶解，同时不破坏DNA完整性。
本次实验中，此亦严格按照要求，且水浴时间过长对提取效率影响不大。
4.1.4 其它：酚氯仿用于去除蛋白质；乙醇用于沉淀DNA；离心则是使各种不溶物快速分层。
本次实验中，上述步骤均按实验要求完成。
综上分析，出现拟南芥DNA提取量较少以至肉眼不可见的主要原因是研磨不够充分。经向专家请教，研磨时除须用力按压外，在研磨棒接触离心管底时手腕旋转也要快速。按下过程中则要稍缓，以求碎片不被挤至管壁而无法研磨。
4.2对提取方法的探讨
DNA的CTAB提取法是Murry和Thompson于1980年修改总结前人经验而成的简便提取法，用于利用易处理样品少量提取DNA。然而若作为学生实验，该实验方法有许多可改进之处。
首先、CTAB溶液需用2％CTAB（sigma H-5882）*(W/V)、100mmol/l Tris-HCl（ph 8.0）、20mmol/l EDTA 、1.4mol/l NaCl溶液配制而成，试剂取得难得较大。其次、酚-氯仿有剧毒且挥发性较强，对人体伤害极大，使用危险性高。其目的在于使细胞中蛋白质变性溶解，纯化DNA，该作用同样可由75%乙醇做到。因此可用75%乙醇代替酚氯仿，而CTAB溶液则可用高浓度NaCl溶液代替（电解质溶液不及CTAB溶液可去除脂类、多糖，可能导致实验提取样品不纯），同时研磨过程最好在低温条件下进行，以降低酶的活性，防止DNA被降解。若无离心机仪器也可用静置沉淀的方法代替。
由此，较完整、纯度较高的植物DNA提取可在学生实验室中完成。
5小结
实验中除了了解并初步掌握CTAB法提取拟南芥DNA方法外，还探讨研究了实验中须注意的问题，总结了实验效果不理想的原因并提出改进方案，同时也对学生实验中的植物DNA简易、安全的提取方法提出了一些改进意见。在这次社会实践过程中，不但学习和了解了生物技术最新发展趋势和动态，激发了对生命科学探索的兴趣，更学会了本着科学、严谨的精神对待实验过程、提出问题和改进方法。

[参考文献]
[1]陈宏，基因工程实验技术(面向21世纪课程教材)[M].北京：中国农业出版社，2005.8.
[2]赵晓瑜，李继刚，实用分子生物学技术[M]. 北京：化学工业出版社，2006.6.
[3]杨双，阮燕晔，等. 一种简易的拟南芥幼苗微量DNA提取方法[J].沈阳农业大学学报，2005， 36 (1):99-100.

致谢：实验过程中得到了浙江省林业科学研究院彭华正、金群英等老师的指导，在此一并致谢！